為了提高選擇效率，研究人員將生物技術與常規育種相結合。壹些重要的番茄品質基因如抗病基因Tm-2，I，cf2，cf4，cf5，cf9，Cf-ECP3，Mi，Asc，Fr1，Py-1，Pto，Sw-5，Ve等。、以及Y、R、B. MB等與類胡蘿蔔素合成途徑相關的基因(表24-4)、與番茄光合作用、呼吸作用、糖、脂肪、蛋白質、核酸合成與分解等相關的基因等。已經獲得了與它們緊密連鎖的分子標記。借助分子標記，育種者可以在苗期有效選擇含有目的基因的植株，淘汰大量含有非目的基因的植株，從而提高選擇效率和準確性，縮短鑒定時間，加快育種進程。隨著高密度番茄Tanksley(1992) RFLP分子遺傳圖譜的發表和不斷完善，以及QTL分析技術的建立，育種家操縱和控制產量、品質、抗病性、抗逆性等數量性狀位點(QTL)的願望逐漸實現。借助QTL分析方法，大量野生和馴化種質中的有益QTL被鑒定和分離，AB-QTL(Advaced回交QTL)分析方法的應用也實現了QTL分析與品種選育的有機結合。
表24-4分子標記定位的番茄抗病蟲害基因
表24-4分子標記定位的番茄抗病蟲害基因(續)-1
根據QTL的研究成果，育種者可以利用與QTL緊密連鎖的分子標記高效選擇目標QTL，實現從常規育種選擇表型到直接選擇目標基因的巨大轉變。因此，QTL分析技術壹經產生就受到了極大的關註，人們深信該領域研究成果的應用將會給作物育種帶來巨大的變革。
分子標記的類型及其在番茄上的應用:基於DNA的分子標記在基因組中分布廣泛，具有多態性高、信息量大、重復性和穩定性好、分析效率高的優點。它們廣泛應用於番茄遺傳育種研究的各個方面，如遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、目標性狀基因標記和定位(包括品質性狀和數量性狀)、分子標記輔助選擇和品種純度鑒定等。分子標記主要包括以下類型:
1.RFLP(限制性片段長度多態性)
Botstein(1980)等人首先提出了這壹技術，Vallejos和Tanksley利用這壹技術獲得了與番茄R45s、RBCS1、RBCS2、RBCS3、CAB1、CAB2和CAB3基因緊密連鎖的RFLP標記。後來的林肯(1987)，皮歇斯基(1987，65438+CAB8，1989)，沙夫(1990)，羅特曼(1991)。研究了HSF8、HSF24、HSF30、ACC1、ACC2、ACC3、ACC4和ACC1的標記，獲得了相應的RFLP標記。在1989中，Young和Tanksley使用RFLP標記分析了帶有Tm-2或Tm-2進入商陸的野生物種的染色體片段。他們選擇了Tm-2基因座兩側的RFLP標記，分析了來自不同育種來源的65，438+02 Tm-2和Tm-2菌株。發現最大的漸滲基因片段幾乎包含了9號染色體的整個短臂，圖譜距離可達565，438+0 cm，最短的只有4cM左右。從65438到0992，Tanksley基於普通番茄和Panali番茄雜交後代群體開發了近900個RFLP標記，建立了高密度番茄的RFLP分子遺傳圖譜。到目前為止，美國康奈爾大學公布的茄果類蔬菜作物中僅有2330個RFLP標記。
2.RAPD(隨機擴增多態DNA)
Williams等人(1990)基於PCR原理發明了RAPD技術。在番茄中，韋德(1993)等人從含有Panali番茄的普通番茄漸滲系中獲得了100個6號染色體特異性RAPD標記，其中13個標記位於形態標記yv(黃色病毒)和tl(無硫胺素)之間。Vander(1992)、Egashira(2000)等人利用RAPD方法對普通番茄和各種野生番茄進行聚類分析，結果為番茄的分類提供了很好的證據。羅(1995)、維蘭德(1998)、李繼紅(1999)、浦(2000)、高嵐(2001)、(2002)等。然後分析了RAPD的番茄種質資源或品種。Yaghoobi(1998)等人利用RAPD技術標記了新發現的抗線蟲基因Mi-3。在520個隨機引物中，發現2個連鎖標記。其中，NR14與RFLP標記TG180緊密連鎖，使Mi-3位於染色體12的短臂上。畢等利用288個10或12堿基的隨機引物對青枯病抗性基因進行了標記，發現了4個連鎖標記，其中2個與壹個高效基因連鎖。此外，Ohomori(1995)、Motoyoshi(1996)、Pillen(1996)、Dax E.(1998)、田妙英(2000)等人先後開發了番茄煙草花葉病毒抗性基因Tm-2和Tm-2。
3.簡單序列重復
Broun(1996)利用GATA和GACA的重復序列來繪制番茄圖譜。結果表明，重復序列在番茄基因組中不是隨機分布的，而是分布在著絲粒附近。作者認為這兩個重復序列可以用來檢測品種的多態性。Kaemmer(1995)用(GACA)4作為探針進行RFLP分析，結果表明幾乎每個品種都會產生唯壹穩定的指紋圖譜，因此可以廣泛用於品種鑒定。欒(1999)也得到了相似的結果，建立了9個番茄品種的SSR標記。目前，美國康奈爾大學公布的茄科作物中有734個SSR標記。
4.擴增片段長度多態性
Thomas C.M.(1995)從番茄與野生種番茄種間雜交的F2群體中獲得了42000條AFLP條帶，其中有3個AFLP標記(M1，M2，M3)分離自Cf-9基因* * *，這3個標記位於Cf-9基因兩側0.4cM的區域。用這些標記分析含有Cf-9基因的質粒，發現M1和M2標記分別位於Cf-9基因周圍15.5kb的位置。最近通過AFLP或轉座子標簽技術在Cf-4和Cf-9基因附近發現了壹些新的弱抗性的抗葉黴病基因(Takken et al .，1999)。
5.序列特征擴增區
Williamson V M(1994)獲得番茄抗根結線蟲基因Mi的SCAR標記，Chague v (1996)獲得番茄抗葉枯病病毒基因Sw-5的SCAR標記。
6.***顯性SCAR標記
中國農業科學院蔬菜花卉研究所鮮番茄研究組利用SCAR標記原理和多引物PCR技術，建立了* * *顯性標記技術(CODominant–SCAR)，即在獲得與父本和母本基因型壹致的顯性SCAR標記的基礎上，將雙親的特異性引物加入到同壹個PCR反應體系中，獲得了壹種可以同時鑒定父本、母本及其雜合子基因型的標記方法。該標記是壹種非常穩定的分子標記，具有重復性好、快速、簡便、應用成本低等特點，適合大量樣品分析。對農作物雜交種子純度鑒定、新品種審定和品種知識產權保護具有重大的實際應用價值。
7.序列標簽位點
STS是壹個長度為幾百bp的特異性片段，是根據單拷貝DNA片段兩端的序列設計壹對特異性引物，擴增基因組DNA產生的。由於采用常規PCR引物長度，其擴增結果穩定可靠。RFLP標記可以通過兩端測序轉化成STS。STS在基因組中往往只出現壹次，可以定義基因組的具體位點(Olson et al .，1989)。STS的物理作圖可以通過PCR或雜交來完成，這使得物理作圖方便快捷。STS在基因組研究中具有重要意義，因為它可以作為比較遺傳圖譜和物理圖譜的* * *同構點。之後K.MeKsem(2001+0)轉化了10個AFLP標記，獲得了6個STS標記。
8.切割擴增多態性序列標記位點
CAPS和SCAR、STS等標記壹樣，也是轉化RFLP、AFLP、RAPD等標記的方法。擴增後，CAPS標記的特異性引物的產物的電泳條帶不顯示多態性，但用限制性內切酶消化後，通過電泳檢測可以顯示PCR產物。CAPS標記揭示了特定PCR擴增產物DNA序列中限制性位點變異的信息，表現為* *顯性標記。在番茄中獲得了抗線蟲病Mi、TMV Tm2、葉黴病cf5、cf9、白粉病Fr1和細菌性葉斑病Pto基因的CAPS標記。目前，康奈爾大學公布的茄科作物中有84個CAPS標記。
9.多重切割擴增多態性序列標記位點
RFLP和AFLP具有操作復雜、時間長、需要放射性步驟和成本高的缺點。因此，為了降低成本和提高效率，在分子圖譜的構建、分子育種和QTL分析中，壹些RFLP標記、AFLP標記和COS標記被轉換成CAPS標記。在將RFLP和COS標記轉變為CAPS標記的過程中，發現壹些CAPS標記共用相同的限制性內切酶。考慮到多重PCR可在同壹擴增反應中使用不同引物對同時擴增相應序列的優點，以及多個CAPS標記共享同壹限制性內切酶的事實，基於多重PCR和CAPS的原理，建立了多重CAPS技術，該技術結合了多重PCR和CAPS的優點，可用於番茄的快速遺傳鑒定和分子育種(王，杜等，2003)。目前，該方法已成功應用於番茄抗葉黴病基因和抗根結線蟲基因的分析。
10.單核苷酸多態性
通過測序，然後與相關基因組中相應區域的核苷酸序列進行比對，可以檢測出核苷酸序列的差異，其中壹部分是由單核苷酸的差異造成的，這種遺傳多態性就是SNP標記。K.Meksem等人(2001)成功地將番茄中的AFLP標記轉化為SNP標記。SNP標記極其豐富，覆蓋全基因組，具有廣闊的應用前景。
總之，分子標記技術發展迅速。隨著生物技術的發展，將會開發出更多的技術。將分子標記輔助選擇技術與常規番茄育種相結合，可以提高目標性狀的選擇精度和效率，從而加快番茄育種進程。隨著番茄基因組計劃[番茄基因組計劃(# 9872617)，(http://www.nsf.gov/bio/DBI/DBI _ PGR . htm)]的實施和基因芯片技術的發展和不斷完善，將為番茄飽和連鎖圖譜的構建提供大量的DNA數據信息，並對大量個體進行遺傳。利用番茄基因組的序列信息，可以直接對DNA序列進行比對分析，揭示個體間單核苷酸水平的多態性，從而開發出覆蓋全基因組的極其豐富的SNP標記。通過使用基因芯片技術，所有基於DNA序列的分子標記(如RFLP、RAPD、CAPS、STS、SNP等。)，克隆基因的探針，EST等上千種DNA序列都可以固定在壹個芯片上。只要將每個種群中的單株DNA與之雜交，借助自動分析程序和信息管理系統，就可以快速、準確、高通地鑒定出大量的單株。將芯片技術應用於番茄育種材料的遺傳分析，將有助於優質基因和QTL的精細定位和克隆，也有助於現代番茄品種改良技術和分子輔助育種技術和方法的進壹步完善。