報告基因:編碼可檢測的蛋白質或酶的基因，即其表達產物易於識別的基因。
通常，報告基因的編碼序列與基因表達調控序列融合形成嵌合基因，或與其他靶基因融合，以利用其表達產物校準靶基因的表達調控。
報告基因廣泛應用於基因表達調控的研究。例如綠色熒光蛋白(GFP)和熒光素酶。
熒光素酶是壹種能催化不同底物氧化發光的酶。哺乳動物細胞中沒有內源性熒光素酶。
熒光素酶報告基因的優勢
蛋白質不需要翻譯後加工，所以壹旦翻譯出來，就立刻產生報告活性。
在所有的化學發光反應中，它的光產物的量子效率最高，所以非常靈敏。此外，在宿主細胞和檢測試劑中不能檢測到背景發光。
快速檢測，每個樣本只需要幾秒鐘。
二、實驗原理
基於熒光素酶與底物之間的化學發光反應，將感興趣的基因轉錄調控元件克隆到螢火蟲熒光素酶基因的上遊，構建熒光素酶報告質粒。然後轉染細胞，在適當的刺激或處理後裂解細胞，並測定熒光素酶活性。通過熒光素酶的活性來判斷刺激前後不同刺激對感興趣的調節元件的影響。
同時，為了減少內部變化因素的影響(如培養細胞數量和活力的差異，細胞轉染和裂解的效率等。)，用帶有Rinilla熒光素酶(phRL-TK)的質粒作為對照質粒和報告基因質粒* * *轉染細胞，提供轉錄活性的內部對照，使測試結果不受實驗條件變化的幹擾。在測量過程中，當加入熒光素酶檢測試劑II (LARII)時，產生螢火蟲熒光信號，從而首先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。量化螢火蟲的熒光強度後，加上Stop &；Glo？試劑，淬滅上述反應，同時啟動海腎的熒光素酶反應，同時進行第二次測定。
三。操作程序和結果判定
A.檢測前相關試劑的準備
1.？1X PLB裂解緩沖液的制備:在1倍體積5X PLB裂解緩沖液中加入4倍體積的水或PBS。(使用前，在室溫下平衡1X緩沖液，平衡需要2-3分鐘)。
2.？熒光素酶檢測試劑ⅱ(LARⅱ)的制備:將熒光素酶檢測緩沖液ⅱ加入熒光素酶檢測底物中，充分混合，分裝，避光-20℃保存。(準備好後分裝到小試管中，避免反復凍融)。使用前，將準備好的LAR II從-20℃取出，平衡至室溫(需要20-30分鐘)。
3.？停止& ampGlo？試劑準備:即用型準備，第壹站&；Glo？將緩沖液放入37度培養箱中平衡至室溫(15-30min)，然後50x stop &；Glo？底物加入49倍體積的Stop &；Glo？緩沖中。
B.樣品制備
1.？小心地從待檢測的細胞孔中吸出生長培養基。用1XPBS沖洗細胞2-3次。這個過程壹定要小心，盡量用PBS吸收沖洗液(防止細胞脫落)。
2.？向24孔板的每個孔中加入100-150μl 1x PLB裂解緩沖液以覆蓋細胞，然後在振蕩器中搖動24孔板20-30分鐘，以確保裂解緩沖液完全裂解細胞。
C.雙熒光素酶檢測法(Promega GLOMAX)(註意:系統運行時請勿觸摸操作屏幕)
1.？重置系統:工具？設置重置
2.？雙熒光素酶檢測程序的設置；
協議？運行Promega協議？DLR-O-INJ OK
3.？將50μl LAR II加入1.5ml EP管(專用進口EP管)，將10μl細胞裂解液加入裝有LAR II的1.5ml EP管，吹2-3次混勻(盡量不要吹出氣泡)，放入檢測器，點擊“測量”開始讀數(螢火蟲熒光素酶反應強度)。(使用前，LAR II應混合均勻並平衡至室溫。)
4.？測量結束後，取出EP管，然後加入50μl STOP &；Glo？試劑，吹2-3次混勻(盡量不吹氣泡)，再次放入檢測器，點擊“測量”開始讀數(內參海腎的熒光素酶反應強度)。(停止& amp
Glo？試劑當前可用，無法保存)
5.記錄讀數:每個樣品會有三個值:rlu 1-螢火蟲熒光素酶反應強度，rl U2-內參海腎熒光素酶反應強度，比值-RLU1/RLU2。壹般記錄比值即可，但RLU1和RLU2是實際的熒光強度值，可以反映細胞的轉染效率，報告質粒與內參的比值也可以根據實際的熒光強度進行調整。
6.測量結束後，請取出最後檢測到的EP管並關閉儀器。
7.實驗結果的處理與分析:采用雙樣本等方差T檢驗進行處理，P < 0.05為顯著差異，P < 0.01為極顯著差異。
四、註意事項
1.因為溫度對酶反應有影響，所以樣品和試劑在測定前都應達到室溫。
2.海腎熒光素酶檢測用工作液應在配制後立即使用，配制後不宜長時間保存。
3.熒光素酶檢測試劑II (LAR II)不能反復凍融，所以每次都可以使用同批次的LAR II。制備的LAR II在-20℃下可穩定儲存壹個月，在-70℃下可穩定儲存壹年。
4.試劑在儲存和使用時應避光保存。
5.為了獲得最佳的測定效果，從樣品和測定試劑混合到測定的時間應盡可能控制在同壹時間內(1-2秒)。
6.使用過程中請勿觸摸操作屏幕(程序將被終止或取消)。
7.平時盡量不要移動儀器，防止觸摸屏移動。