冷凍細胞從液氮中取出後，在37℃的水浴中不斷搖動以促進其融化。轉移至15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM完全培養基，輕輕吹勻，2000 rpm離心2 min，棄去上清液。
加入10ml DMEM培養基清洗，棄去上清液。加入10ml DMEM完全培養基，輕輕吹，接種於10cm平板中，於含5%CO2的細胞培養箱中培養。
第二，細胞傳代
當細胞密度達到80%~90%時，除去培養基，用10ml PBS洗滌兩次。加入含0.25%EDTA的3ml胰蛋白酶3min，置於細胞培養箱中3分鐘。加入1毫升DMEM完全培養基以終止胰酶消化，並轉移至15毫升離心管中。
加入10ml PBS清洗細胞培養板，轉移至15ml離心管，2000 rpm 2min，棄去上清液。加入10ml PBS(高壓滅菌，40℃保存)，吹勻，吸取10微升計數，按1×106個/板接種，在含5%CO2的細胞培養箱中繼續培養。
第三，細胞冷凍保存
當細胞密度達到80% ~ 90%時，除去培養基，用10ml PBS洗滌兩次。加入含0.25%EDTA的3ml胰蛋白酶3min，置於細胞培養箱中3分鐘。加入完全培養基lmlDMEM以終止胰酶消化，並轉移至15ml離心管中。加入10ml PBS清洗細胞培養板，轉移至15ml離心管，2000 rpm 2min，棄去上清液。
加入lml冷凍液(90%血清，10%DMSO)，放入冷凍箱(箱內有異丙醇，保證降溫速度)，立即放入80℃冰箱，過夜，第二天放入液氮中，可保存至少兩年，如果液氮不釋放，可保存三個月。
凍存液的制備:應緩慢加入70%完全培養基+20% FBS+10% DMSO，同時搖動。
需要註意的事項
(1)進入細胞間隙開始細胞培養時，必須嚴格遵循以下步驟:
①確保用於細胞操作的所有溶液和消耗品都已經消毒和測試，沒有問題。不使用不確定的解決方案和耗材，不借用別人的解決方案，除非有特殊情況。
(2)確保衣服的袖口已經卷起來或者白大褂的袖口已經系好。
③確定酒精燈中的酒精量，必要時及時補充。
(4)確保所有需要的溶液和消耗品都在手邊。為了用壹只手打開瓶蓋，在實驗開始之前，所有的瓶蓋都可以擰開。
⑤除非瓶口沒有燒焦，否則盡量不要直接倒溶液。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴有75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍(不要接觸瓶口)，然後簡單地在火焰上燃燒。
6.如果在操作過程中不確定使用的耗材是否幹凈，壹定要及時更換。
⑦實驗結束後及時清理，保持工作區域幹凈整潔，最後用75%的酒精清洗桌子。
(2)防止細胞汙染
(1)實驗用品防止汙染。細胞培養所用的試劑、耗材、設備要徹底清洗消毒，各種溶液要仔細滅菌，無菌試驗陰性後才能使用。手術室和剩余無菌設備應定期清洗、消毒和滅菌。
(2)操作過程防止汙染。
③易產生靜電或吸附灰塵的衣服，進牢房前壹定要換上白大褂。
(4)實驗前，要確定戴的手套沒有問題。手套只要接觸到生物安全櫃外的物品，就必須及時消毒。
⑤進入細胞培養室後關好門，盡量少坐少走，以免影響生物安全櫃的空氣幕。開始工作前，用75%酒精棉球擦拭雙手和瓶蓋。事先嚴格檢查使用的設備、溶液和細胞，不要將汙染或未消毒的物品帶入無菌室，更不要隨便使用，以免造成大規模汙染。
⑥細胞操作要輕，瓶口必須在火焰周圍的無菌區打開，瓶口要簡單旋轉，在火焰周圍燒灼。小心不要讓火焰熔化塑料瓶口。
⑦實驗操作過程中，生物安全櫃的隔板應盡可能降低，盡量減少交談。打噴嚏或咳嗽時千萬不要指向工作區域，以免造成不必要的汙染。
⑧瓶蓋要放在遠離自己的地方，以免被誤操作汙染。
⑨不要從敞開的容器口上方通過，以免不明物體從衣服上掉落汙染細胞。
⑩實驗操作時應註意及時更換巴斯德移液管、移液管槍尖和移液管，決不能壹管到底。壹旦發現不幹凈或不能確定幹凈的物品，必須直接丟棄。實驗結束後要及時清理，保持實驗室幹凈整潔，最後用75%的酒精清洗桌子。
(3)防止細胞交叉汙染
①進行各種細胞培養操作時，所用的儀器應嚴格區分，最好做好標記，便於識別。按順序進行操作時，壹次只處理壹個細胞，多個細胞、多個操作壹起進行，容易出現T-混沌。
(2)在液體交換或通過操作時，移液器頭和裝有細胞的移液器不要接觸試劑瓶的瓶口，以免將細胞帶入培養基，汙染其他細胞。
(3)所有細胞壹旦購買、從外地引進或自行建立，必須及時保存和冷凍，壹旦汙染，可以復蘇培養。
擴展數據:
細胞培養是在體外模擬體內環境(無菌、適宜的溫度、酸堿度和壹定的營養條件)，使其能夠存活、生長、繁殖並維持其主要結構和功能的壹種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，生物學上的正式術語是細胞培養技術。
無論對於整個生物工程技術還是生物克隆技術之壹，細胞培養都是必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以將壹個細胞經過大量培養後轉化為簡單的單細胞或分化很少的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，細胞培養本身就是細胞克隆。
細胞培養技術是細胞生物學研究方法中壹項重要且常用的技術。通過細胞培養，可以獲得大量細胞，研究細胞信號轉導、細胞合成代謝、細胞生長和增殖。
參考資料:
百度百科:細胞培養