死細胞的鑒定壹般用DNA結合染料排除,利用死細胞膜通透性增加,DNA染料不破膜就能進入的特性可以鑒定死細胞,但使用的染料濃度和時間遠低於細胞周期中使用的染料,不需要固定。
常用的核酸結合生死識別染料包括:
碘化丙錠
4 ',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)
7-氨基放線菌素D
DRAQ7
SYTOX
但有些細胞內抗原(細胞因子和轉錄因子)需要固定和斷裂,所以在上述染料中,除了壹些胺類染料(如活/死、鬼等。)和新蒽醌染料CyTRAK Orange,其他染料已不再適合用於此類標本的細胞生死鑒定。
在這裏,我將只解釋與PI,7-AAD和DAPI的染色方法。請遵循其他商業染料的說明:
1.用0.5毫升0.5毫升1×PBS懸浮細胞。
2.加入PI或DAPI或7-AAD,最終濃度為PI(5?g/ml)、DAPI(500-1000 ng/ml)、7-AAD(2.5?m)
3.加入以上染料後,盡快上機,壹般不超過5分鐘(有的廠家說明書上說10分鐘,可能和濃度有關,可以按照說明進行)。
PI檢測通道:488 nm激發,610/20 BP采集。
DAPI檢測通道:最好使用355nm激發,440/40BP采集;也可在405nm激發,450/50BP收集。
7-AAD檢測通道:488nm激發,670/14BP收集。
下圖是用PI檢測細胞生死的結果:
1.細胞死亡:作為生物體內的普遍現象,動物細胞的細胞死亡有三種方式:雕亡、自噬和壞死。前兩種屬於程序性細胞死亡?細胞?死亡,PCD).細胞壞死是壹種非正常死亡,由質膜破裂和內容物的炎性滲漏引起。細胞的PCD是細胞的壹種“主動”死亡行為,在形態和功能上與細胞壞死有很大不同。
2.植物中的細胞程序性死亡(PCD):目前根據液泡膜破裂後細胞質中是否有快速降解,可將PCD分為兩類。第壹種是自溶)PCD,與液泡中水解酶的釋放有關,導致液泡破裂後細胞質迅速被清除。第二種是非自溶PCD,即液泡膜破裂但沒有迅速清除細胞質。目前,細胞PCD類型的鑒定主要基於細胞形態學。
3.動植物細胞雕亡標準:動物:雕亡:雕亡小體,或細胞表面的水泡,被病原體感染後在其他細胞內降解。自噬:促進細胞溶解的自噬體、自溶體和小空泡數量增加並壞死:沒有上述定義的標準。植物:自溶:細胞膜破裂後細胞質的快速清洗。非自溶:細胞質沒有快速清理。其他:染色質濃度、核破裂、自標記信號、自攝食信號、細胞擴張、細胞器擴張、質膜破裂、染色質濃度。液泡體積的增大(細胞質體積的減小)需要Ca2+的內流,細胞質收縮,細胞器擴張,小泡增大但體積不增大。