不壹樣。從特殊組織中提取DNA時,必須參考文獻和經驗建立相應的提取方法,以獲得有用的DNA大分子。特別是組織中的多糖和酶對後續的酶切和PCR反應有很強的抑制作用,所以在用富含這些物質的材料提取基因組DNA時,要考慮去除多糖和酚類物質。
本實驗以水稻幼苗為材料,學習基因組DNA提取的壹般方法。
脫氧核糖核酸
壹.材料
水稻幼苗
第二,設備
移液管、冷凍高速離心機、臺式高速離心機、水浴鍋、陶瓷研缽、50ml偏心管(有蓋)、5ml和1.5ml離心管、彎成鉤子的小玻璃棒。
第三,試劑
1,提取緩沖?:100mmol/L Tris?氯,pH8.0,20毫摩爾/升EDTA,500毫摩爾/升
氯化鈉,1.5%十二烷基硫酸鈉.
2.提取緩沖區?:18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸鈉,6.0gPVP,240ul巰基乙醇,加水至300ml。
3,80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4.核糖核酸母液:配方見第壹章。
5.其他試劑:液氮、異丙醇、TE緩沖液、無水乙醇、70%乙醇和3mol/L NaAc。
四、操作步驟:
(1)從水稻幼苗或其它禾本科植物中提取基因組DNA
1.向50毫升離心管中加入20毫升提取緩沖液。, 60?水浴預熱。
2.稻苗或葉5-10g,切塊,在研缽中加入液氮磨成粉末,立即倒入研缽中預熱。
在離心管中,用力搖晃並混合均勻,60?水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA得率高),並不時搖動。
3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,倒置混勻(需戴手套防止皮膚損傷),室溫靜置5-10分鐘,使水相和有機相分離(必要時再混勻)。
4.在室溫下以5000rpm的速度離心5分鐘。
5.小心地將上清液轉移到另壹個50ml離心管中,加入1倍體積的異丙醇,混勻,室溫放置壹段時間,產生絮狀DNA沈澱。
6.將1毫升TE加入1.5毫升eppendorf中。用帶鉤的玻璃棒取出DNA絮狀物,吸幹在幹凈的吸水紙上,轉移到含有TE的離心管中,DNA會迅速溶解在TE中。
7.如果DNA沒有形成絮狀沈澱,可以5000rpm離心5分鐘,然後將沈澱轉移到te管中。這樣收集的沈澱物往往很難溶解在te中,但在60?在水浴中放置15分鐘以上,以幫助溶解。
8.以3000rpm離心DNA溶液5分鐘,並將上清液倒入幹凈的5ml離心管中。
9.加入5μl核糖核酸酶(10μg/μl),37?10分鐘去除RNA(RNA壹般對DNA操作和分析沒有影響,可以省略這壹步)。
10.加入1/10體積的3mol/L NaAc和2倍體積的冰乙醇,混勻,-20?靜置20分鐘左右,DNA形成絮狀沈澱。