本發明公開了壹種好氧反硝化細菌及其在汙水處理中的應用，申請人通過富集從濕地中篩選出壹種好氧反硝化細菌，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，CCTCC NO：M2013488。該細菌可用於處理高NO3-的廢水，最高去除率可達99.6%，且無亞硝態氮的累積，並可同時去除有機廢水中的COD，去除率可達60%-80%。相比其他報道的用於汙水處理的好氧反硝化細菌，本發明菌株對汙水處理高效，24h後對硝態氮的去除率可達99.6%，脫氮速率可達22.6mg?L-1?h-1，其除氮效率是已報道菌株的1.51～4.57倍，可以單獨使用或者固定化後應用於廢水處理中，應用廣泛。
權利要求書
1.壹種好氧反硝化細菌，其特征在於：施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，CCTCC NO：M 2013488。
2.權利要求1所述的好氧反硝化細菌在汙水處理中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在於，該好氧反硝化細菌用海藻酸鈉進行固定。
4.根據權利要求2所述的應用，其特征在於，該好氧反硝化細菌用聚乙烯醇進行固定。
5.根據權利要求2所述的應用，其特征在於，該好氧反硝化細菌用海藻酸鈉和聚乙烯醇進行固定。
說明書
壹種好氧反硝化細菌及其在汙水處理中的應用
技術領域
本發明屬於環境微生物領域，具體涉及壹種好氧反硝化細菌，還涉及該細菌在汙水處理 中的應用。
背景技術
近年來，工業廢水的大量排放以及農業大量施用化肥，導致氮素汙染引起的水環境問題 日益突出，而其中硝酸鹽汙染問題尤為嚴重。硝酸鹽及其衍生物因具有致病、致癌作用而影 響人類健康。因此，加大對汙水中氮素汙染的治理，尤其是提高硝酸鹽氮的處理效率是目前 汙水處理技術中亟待解決的問題。
生物反硝化脫氮是利用微生物的作用，在厭氧或缺氧條件下，以硝酸鹽替代氧作電子受 體將硝酸鹽逐步還原為氣態產物脫除，是壹種經濟有效的脫氮方式。但往往由於受到厭氧和 缺氧條件的限制，生物脫氮過程進行的並不徹底。好氧反硝化菌的出現使得反硝化過程更容 易控制，其是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧條件下進行反硝化作用的壹類反硝化細菌。 自20世紀80年代，Robertson等(Robertson et al.Archives of Microbiology,1984,139,351-354) 在除硫和反硝化處理系統中首次分離出好氧反硝化菌以來，人們對於好氧反硝化菌的脫氮性 能已經進行了壹定程度上的研究。然而已篩得的好氧反硝化菌大部分脫氮效率不高，壹般在 溶解氧濃度較低時才會具有反硝化活性，因此，篩選分離出高效的好氧反硝化細菌菌株，並 將其應用於實際汙水處理中，以節約脫氮成本，提高經濟效益具有十分重要的意義。
發明內容
本發明的目的在於提供壹株好氧反硝化細菌，該細菌已於2013年10月23日送往中國 典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名：施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，保 藏編號：CCTCC NO：M2013488。該菌株具有高效脫除水體中硝酸鹽氮的能力。
本發明的另壹個目的在於提供了壹株好氧反硝化細菌在汙水處理中的應用，單獨使用該 菌，或者將該菌進行固定化後投放到水體中，均可以有效地去除水體中的硝酸鹽氮，且無亞 硝態氮的累積，並且除氮速度快。
為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：
壹種好氧反硝化細菌，其篩選過程是：
(1)富集
於2013年5月從增氧型復合垂直流人工濕地小試系統兩套系統中采集土壤樣品，采樣 深度為表層10cm。無菌條件下稱量10g土壤接入500mL的液體培養基中進行富集，利用間 歇曝氣法進行富集，間歇時間為12h，每次曝氣3h，於30℃溫箱培養，每五天轉接壹次， 富集時間1個月。測得硝態氮的去除率為99.9%，基本上沒有亞硝氮的累積。
所述液體培養基為KNO32g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO40.2g，檸檬酸 鈉5g，微量鹽溶液2mL;蒸餾水1000mL。
(2)初篩
采用塗布法將富集得到的菌懸液均勻塗布於BTB選擇性培養基，30℃溫箱培養3d後， 選取變藍的菌落或暈圈作為初篩菌。
(3)復篩
將初篩的菌株接種於液體培養基，30℃，120r·min-1搖床培養5d，進行復篩。每24小 時利用格氏試劑、二苯胺試劑顯色來檢測硝酸鹽的降解情況，選取去除效果好的菌株。
所述BTB培養基為：瓊脂20g，KNO31g，KH2PO41g，FeCl2·6H2O0.5g，CaCl2·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O1g，琥珀酸鈉8.5g，BTB(1%溶於酒精)1mL;蒸餾水1000mL，用 1mol·L-1NaOH調節pH至7.0～7.3。
通過綜合比較硝態氮的去除率，亞硝態氮的累積量以及硝態氮的去除速率等指標，最終 從28株初篩菌中篩選出壹株好氧反硝化細菌JH-1，其16SrRNA為SEQ ID NO.1所示。該 細菌已於2013年10月23日送往中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名：施氏假單 胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，保藏編號：CCTCC NO：M2013488，地址：中國武漢 武漢大學。
JH-1為革蘭氏陰性菌，為短桿菌，長為1.0um—1.5um,寬為0.2um—0,4um,無芽孢和鞭 毛，在固體培養基上形成不透明的白色菌落，菌落表面光滑，邊緣整齊。
JH-1生理生化特性–酶活、碳源同化
+：陽性，-：陰性，
JH-1生理生化特性--酶活
+：陽性反應;-：陰性反應;W：弱陽性反應
壹種好氧反硝化細菌在汙水處理中的應用，其步驟是：
(1)將活化後的菌液接種於待處理的含氮廢水中，投加量為受處理廢水體積的5%，pH 範圍為7.0-7.3，在搖床(30℃，120r/min)條件下，定時取樣檢測水樣中硝態氮、COD的 去除率及亞硝態氮的累積量。
(2)用三種不同的基質包埋細菌獲得固定化好氧反硝化細菌，並用於廢水脫氮處理中
A、海藻酸鈉固定法：稱取4g海藻酸鈉溶解到60mL的0.9%的生理鹽水中，高溫高壓 (121℃，105-110kPa)滅菌冷卻至室溫(20-25℃)，與80mL好氧反硝化細菌懸浮液充分混 合，滴入4%w/v的CaCl2溶液中，冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球;將形 成的小球放置於4℃冰箱中交聯固化12-24h後，用生理鹽水洗滌2-3次備用。
B、聚乙烯醇固定法：配制60mL10%w/v的聚乙烯醇溶液，高溫高壓(121℃，105-110kPa) 滅菌冷卻到室溫(20-25℃)，與80mL好氧反硝化菌懸液充分混合，滴入飽和硼酸溶液中， 冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球;將形成的小球放置於4℃冰箱中交聯固 化12-24h後，用生理鹽水洗滌2-3次備用。
C、海藻酸鈉和聚乙烯醇固定法：5%w/v聚乙烯醇和5%w/v的海藻酸鈉的混合溶液60mL， 加熱使其完全混合，高溫高壓滅菌(121℃，105-110kPa)，冷卻至室溫(20-25℃)，與80mL 好氧反硝化菌懸液充分混合;將此混合液用註射器擠入到4%w/v的CaCl2溶液中，冰浴， 邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球;將形成的小球放置於4℃冰箱中交聯固化11-13h， 用無菌水清洗小球，再放入飽和硼酸溶液中，於4℃冰箱中交聯固化11-13h，用生理鹽水洗 滌2-3次備用。
將A、B、C三步制得的好氧反硝化細菌小球從冰箱中取出，用雙蒸水或者0.9%w/v的 生理鹽水洗滌3-4次，然後浸泡在0.9%的生理鹽水中，曝氣約11-13h左右以活化固定化小 球，將壹定量活化後的固定化小球填充到人工濕地模擬柱中，進行廢水脫氮處理研究。
(3)於天然湖水中加入適量外加碳源檸檬酸鈉，將經24h活化的施氏假單胞菌JH-1 按5%的接種量接入湖水中，搖床(30℃，120rpm)培養48h測定水體中硝態氮以及亞硝 態氮的量。
與現有技術相比，本發明具有如下優點和效果
本發明菌株可利用的碳源和氮源範圍廣泛，易於培養。
本發明菌株可用於處理高NO3-的廢水，最高去除率可達99.6%，且無亞硝態氮的累積。
本發明菌株可同時去除有機廢水中的COD，去除率可達60%-80%。
本發明菌株可以單獨使用或者固定化後應用於廢水處理中，應用廣泛。
相比其他已發現的好氧反硝化細菌，菌株JH-1是壹株非常高效的好氧反硝化細菌，24h 後對硝態氮的去除率可達99.6%，脫氮速率可達22.6mg·L-1·h-1，已報道分離出的好氧反硝化 菌其脫氮速率大多數在4.50～13.7mg·L-1·h-1。JH-1脫氮速率是這些菌的1.51～4.57倍。