摘要
本實驗采用堿變性法提取大腸桿菌DH5α(pUC19)的質粒DNA，通過壹系列分離純化技術將質粒DNA與染色體DNA、RNA、蛋白質等雜質分離，獲得純化的質粒DNA分子。通過瓊脂糖凝膠電泳，可以根據DNA條帶的位置大致判斷分子大小，將實際電泳結果與理論結果進行比較，分析產生差異的原因，從而改進實驗方法和嚴謹的實驗步驟。
堿變性；分離純化技術；瓊脂糖凝膠電泳
介紹
質粒是大部分環狀DNA的壹部分，與細菌細胞中的主染色體壹起存在，可以自主復制。細菌質粒的相對分子量範圍從1kb到200kb以上。有些質粒總是獨立於染色體，而有些則會在壹定條件下可逆地整合到宿主染色體中，隨著染色體的復制而復制，並通過細胞分裂傳遞給後代。在基因工程中，質粒經常被用作基因的載體。目前已發現數百種具有質粒的細菌，已知的細菌質粒大多是閉合的環狀DNA分子。質粒是基因工程中的重要載體，其主要功能是攜帶壹些基因片段(可以是編碼基因、調控區等。)，在細胞內環境中表達或參與通路的相互作用。通過將質粒轉化到宿主細胞中，我們可以探索基因的相互作用，獲得蛋白質產物，並實現特定基因片段的克隆。總之，質粒在生物科學研究中有著廣泛的作用。
有許多提取和純化質粒DNA的方法。目前常用的方法有:堿裂解/堿變性法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-***銫密度梯度離心法、向導法。其中，堿變性提取法最為經典和常用。堿裂解/堿變性法是壹種基於染色體DNA和質粒DNA變性和復性差異的分離方法。在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結構解綁變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂了，但超螺旋閉環的兩條互補鏈不會完全分開。當使用具有pH4.8的KAc高鹽緩沖液來調節其pH值至中性時，變性的質粒DNA恢復到其原始構型並儲存在溶液中。染色體DNA無法復性形成纏結的網絡結構，與不穩定的大分子RNA和蛋白質-SDS復合物壹起沈澱，離心去除。最後，通過用冰乙醇沈澱獲得質粒DNA。由於DNA和RNA的性質相似，DNA的乙醇沈澱伴隨著RNA的沈澱，RNaseA可用於降解RNA。質粒DNA溶液中的RNA酶和壹些可溶性蛋白可以通過苯酚/* * *仿抽提去除，最終得到高純度的質粒DNA。
電泳是帶電物質在電場中向與其電荷相反的電極移動的現象。在壹定的pH條件下，各種生物大分子可以解離成帶電荷的離子，這些離子在電場中會向相反的電極移動。凝膠電泳是分子生物學的核心技術之壹。凝膠是壹種具有分子篩效應的電泳支持介質。含有電解質的凝膠在電場中，其中的電離子會發生運動，運動的速度可能會因帶電離子的大小、形狀、電荷量的不同而不同。使用移動
速度差可以區分各種大小不同的分子。因此，凝膠電泳可用於分離、鑒定和純化DNA片段。
主體
1.材料和方法
1.1材料和試劑
實驗材料:大腸桿菌DH5α(pUC19)。
實驗試劑:LB液體培養基，氨芐青黴素(Amp)母液(儲存濃度100mg/mL)，溶液I: 50 mm葡萄糖，25 mm tris-HCl，10mm EDTA(pH 8.0)；溶液ⅱ: 0.2 m NaOH，1% SDS；溶液ⅲ:5m KAC(pH 4.8)；TE溶液:10 mm tris-HCl，1mm EDTA(pH 8.0)；冰乙醇、70%乙醇、RNase A、Tris飽和苯酚、* *仿/異戊醇混合溶液、苯酚/* *仿/異戊醇(PCI)(25:24:1)混合溶液、3M NaAc溶液、滅菌雙蒸水ddH2O、50×TAE緩沖液、60× TAE緩沖液。
1.2實驗方法
大腸桿菌的增值
用牙簽從LB固體培養基中挑取大腸桿菌DH5α(pUC19)菌落，置於l b+ AMP(AMP的工作濃度為100μg/mL)液體培養基中，在37℃、200rpm的培養箱中培養過夜。
實驗前準備
(1)從搪瓷杯中取出壹杯冰塊。
(2)將燒杯放在天平上，調整至平衡。
(3)制備80ml溶液II:由原溶液10m NaOH制備0.2m NaOH和1% SDS。使用8ml SDS、1.6ml NaOH和70.4ml蒸餾水進行配置。
3.大腸桿菌菌株的收獲(4℃操作)
(1)取壹支已滅菌的離心管，稱重，標記為W1 14.552g。
(2)將菌液倒至距離瓶口1/3處，成對平衡。
(3)以6000 rpm離心5min，棄去上清液。
(4)加入5ml溶液I，以6000rpm的轉速渦旋5min，棄去上清液，稱重為W2 14.676g，計算W2-W1 0.124g。
4.細胞裂解以提取質粒DNA (4 C操作)
在菌體沈澱中加入壹定量(按近似菌體量重新組合，配制成溶液I)。
(1)2.0毫升溶液ⅰ，充分渦旋；用溶液I再次平衡。
(2)4.0 mL溶液II，輕輕倒置混勻，冰浴3-5mi。
(3)3.0 mL溶液III，輕輕倒置混勻，冰浴5mi。
(4)12000轉，15分鐘；小心地將上清液轉移到新的離心管中，並記錄體積v。
(5)加入2V冰乙醇，倒置混合均勻；-20℃，65438±05分鐘；。
(6)65438±02000轉/分，65438±05分鐘，棄去上清液。
(7)加入5ml 70%乙醇，12000 rpm，3min，吸去上清液。
(8)重復乙醇洗滌壹次；在37℃下風幹5-65438±00分鐘。
(9)分兩次加入0.5mL TE溶液，將沈澱吹勻，移入Ep管，得到質粒DNA粗提物。
(10)加入5μl RNase A(10mg/ml)，終濃度為50μ g/ml，37℃孵育1-2小時。
5.質粒DNA的純化
將1mL質粒DNA的粗提物分成500μL到壹個新的EP管中，使每組有兩個管。每個EP管的操作如下:
(1)加入等體積的Tris飽和酚，渦旋振蕩，12000rpm，5mi。
(2)將上清液V1(兩管均為400μL)轉移至新管中，加入V1的苯酚/* * *仿/異戊醇混合溶液，渦旋振蕩(
(3)將上清液V2(壹管400μL，另壹管378μL)轉移至新管中，加入V2仿/異戊醇混合溶液，渦旋振蕩(
(4)將上清液V3(兩管均為250μL)移至新管中，加入1/10 V3的3M NaAc溶液(pH=5.2)，再加入2V4(V4=V3+1/10V3)冰乙醇，搖勻。
(5)65438±02000轉/分，65438±05分鐘，棄去上清液。
(6)加入500μl 70%乙醇洗滌，以12000rpm離心2分鐘，棄去上清液。
(7)反復洗滌壹次，吸取上清液，在37℃下風幹5mi。
(8)在每個試管中加入25μL TE溶解並沈澱，合並它們以獲得50μL純化的質粒DNA。
6.1%瓊脂糖凝膠的制備
(1)2L 1×TAE的制備:取40mL 50×TAE，用雙蒸水稀釋至2L。
(2)正確組裝膠槽、膠板和樣品梳。
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文檔介紹:
(3)取40 ml 40mL 1×TAE於250mL潔凈的紅蓋瓶中，稱取0.4g瓊脂糖，混勻，輕輕擰開蓋子，放入微波爐中加熱3-4次，直至溶液澄清無顆粒。
(4)待溶液冷卻至60℃左右時，加入20μL 1mg/ml溴化乙錠(EB)溶液，使EB溶液終濃度為0.5mg/L，混勻後倒入制膠罐中，冷卻固化備用(冷卻固化時間應大於30min)。
7.電泳加載
(1)取2.0μL純化DNA、2μL雙蒸水、1μL 6×上樣緩沖液，用微量移液器吹、吸、混勻。
(2)將凝膠連同制膠板壹起放入電泳槽中，加入1×TAE，直至高出膠面約1mm。
(3)按照以下順序將混合的DNA樣品點樣到凝膠中。。
8.凝膠電泳和DNA分離
(1)打開電泳儀電源，選擇合適的電壓120V，時間40mi。
(3)將電泳槽的電極與電泳儀連接。電泳槽的紅色電極為正極，與電泳儀的正極相連。電泳槽的黑色電極為負極，與電泳儀的負極相連。
(4)開始電泳，只有在負極有氣泡上升時才離開。
(5)電泳結束後，關閉電源，取出凝膠，在紫外燈下觀察電泳條帶。
2.實驗結果
表DNA樣本添加順序
泳道
脫氧核糖核酸
樣本/
標記
超級螺旋標記
UC19
UC 19/Hindⅲ
1組DNA樣本
兩組DNA樣本
三組DNA樣本
四組DNA樣本
五組DNA樣本
超級螺旋標記
樣本量
6微升
5微升
5微升
5微升
5微升
5微升
5微升
5微升
6微升
泳道
10
11
12
13
14
15
16
17
脫氧核糖核酸
樣本/
標記
六組DNA樣本
六組DNA樣本(陽性對照)
7組DNA樣本
八組DNA樣本
9組DNA樣本
10 DNA樣本
UC19
欣德ⅲ
UC19/
樣本量
5微升
5微升
5微升
5微升
5微升
5微升
5微升
5微升
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5,026
5,026
3,049
2,087
堿裂解提取的質粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
在泳道1和9中添加的樣品是超螺旋DNA梯形標記。超螺旋DNA梯狀標記由八種超螺旋質粒DNA組成，DNA大小分別為2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6133 BP、8,023 bp、10085 BP和654,38 BP。5,026 bp的條帶最亮。
泳道2和17中添加的樣品是pUC19質粒。DNA，即* * *價閉環結構的超螺旋質粒DNA，有壹條約2.7kb的帶，起控制作用。
泳道3和16中加入的樣品是用Hindⅲⅲ酶消化的pUC19質粒。pUC19的Hindⅲⅲ酶切結果是閉環結構的超螺旋pUC19質粒DNA的鏈斷裂成線性DNA，線性DNA的電泳速度變慢。但是實驗中使用的Hind ⅲ並沒有完全消化pUC19，所以在3泳道和16泳道之間電泳後會形成兩條帶，其中暗帶是Hind ⅲ消化的pUC19質粒，亮帶是沒有被Hind ⅲ消化的pUC19質粒。
泳道11是不含RNase的對照組的電泳圖像。因為RNA容易形成各種高級結構，所以RNA的電泳速度比同樣大小的RNA快。11泳道下大量亮帶為RNA電泳區。
除15泳道外，pUC19質粒所在區域無明顯條帶，包括15泳道在內的各組均有低條帶，因為堿變性法有缺陷:易導致不可逆變性，不適合提取大質粒。堿裂解是壹種非常激烈的方法。質粒在堿性條件下會變性，而且這種變性時間長了是不可逆的。我們的堿變性時間太長，導致質粒DNA不可逆變性，所以實際帶位置和預測有出入。
除了較低位置的質粒DNA條帶外，每組都有壹條弱雜交帶(用實線箭頭表示)。我們推測這個雜交帶不是沈澱出來的，是加入有機物後渦旋振蕩過程中產生的線性染色體DNA的片段，所以位置向後。這種混合區在4、7、8、10、12、16車道尤為明顯。
在壹些組中，在加樣孔下也有窄的DNA條帶(用線性箭頭表示)。推測該條帶是質粒DNA沈澱中存在少量染色體DNA雜質所致。由於染色體DNA片段太大，1%瓊脂糖凝膠的分辨率受到限制，片段太大的DNA在電泳時通過瓊脂糖凝膠的孔徑極其緩慢或困難，從而在靠近上樣孔處形成狹窄的雜帶。這條帶在4、7、10、12車道尤為明顯。
在個別群體中也有微弱的DNA條帶(用方形箭頭末端表示)。我們推測，未被完全去除的蛋白質可能堵塞了樣品孔，導致少量DNA無法從樣品孔跑到凝膠上。這條帶在4、7、10、12車道尤為明顯。
我們組的質粒DNA(0.124g)在13泳道。與其他泳道相比，我們的質粒DNA的條帶略弱，說明我們組在提取質粒DNA時有壹定的DNA丟失，但我們組的DNA片段和染色體DNA條帶也相對較弱，這可能與我們提取的DNA量較少有關(與第4泳道相比，由於本組提取的質粒DNA量較多，因此， 我們不能因為雜帶少就確定我們組的成績好)，也可能是我們的雜質去除的比較充分(對比14道，我們組雜帶亮度和他們差不多，但我們的目標帶明顯比他們亮)。
討論
加入5ml溶液I，渦旋的目的是重懸和洗滌細菌。溶液I中葡萄糖的功能是為細胞提供等滲環境，
Tris-HCl作為pH緩沖劑，為細胞提供了合適的酸堿環境。EDTA(溶於水，pH 8.0)是壹種重要的金屬螯合劑，能與Mg2+、Ca2+等金屬絡合，抑制DNA被DNase降解。離心後應盡可能去除上清液，以減少培養基對實驗結果的影響。
加入2.0毫升溶液I的作用是重新懸浮和洗滌細菌。
加入4.0 mL溶液二的目的:①SDS能打破分子內和分子間的氫鍵，使分子展開，從而破壞蛋白質分子的二級和三級結構，達到細胞溶解的目的。加入溶液I後，溶液變得清澈粘稠，這是由於細胞破碎，粘稠是由於細胞內蛋白質等有機物沈澱。加入溶液I，慢慢倒置，使其混合均勻，不能劇烈搖動。過度振動會使染色體DNA斷裂成碎片，導致質粒DNA中引入雜質。②NaOH堿裂解變性:NaOH能與蛋白質(細胞膜含蛋白質)結合，使細胞破碎；在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解綁變性，質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋閉環的兩條互補鏈不會完全分離。因此，染色體DNA和質粒DNA可以通過稍後調節pH值來分離。
這壹步的等待時間不能太長，因為強堿也會破壞質粒DNA。
加入3.0 mL溶液III (5 mKAC (pH 4.8))的作用是復性質粒DNA，而染色體DNA太長，無法復性而沈澱出來。不可約染色體DNA和