標題:番瀉葉對小鼠尿量的影響
研究現狀:
首先，支鏈澱粉酶
支鏈澱粉酶(EC.3. 2。1.41)是壹種能特異性切割支鏈澱粉分支點的酶。-1.6糖苷鍵，從而切斷整個側枝，形成直鏈澱粉脫支酶。普魯蘭酶也能分解普魯蘭。普魯蘭酶來源於微生物，而R-酶來源於植物。普魯蘭酶最早是由Bender和Wallenfels在1961中通過產氣桿菌(克雷伯氏菌屬肺炎桿菌為典型細菌)獲得的，他們報道了這種酶良好的酶學性質。之後，各國研究者經過廣泛深入的研究，從不同地域和微生物中獲得了普魯蘭酶，掀起了開發普魯蘭酶的高潮。
在澱粉加工工業中，澱粉酶是最常用的，它的作用是水解澱粉？-1，4糖苷鍵，單獨使用時，產品中含有大量支鏈糊精，包括大量？-1，6糖苷鍵。如果不放澱粉？如果-1，6的糖苷鍵完全分解，必然造成極大的浪費。自然界中，還有能分解澱粉的？-1，6糖苷鍵酶，俗稱脫支酶。喪偶？-1，6葡萄糖苷酶(e.c3.2.1.68，oligo-l，6-葡萄糖苷酶)、普魯蘭酶(e.c3.2.1.41普魯蘭酶)、異澱粉酶(e .支鏈澱粉-6-葡聚糖酶(e.c3.2.1.69，支鏈澱粉-6-葡聚糖酶)，其中普魯蘭酶對底物分子結構要求最小，所以可以所以很多國家都在爭相開發，但到目前為止，只有丹麥的NOVO公司具備普魯蘭酶的生產能力。我國僅進口，但其高昂的價格限制了普魯蘭酶在我國的應用。事實上，我國早在20世紀70年代就開發了壹種普魯蘭酶產生菌，但其酶學性質不適合生產，至今國內尚無普魯蘭酶國產化的報道。
在澱粉加工行業，要求普魯蘭酶的酶學性質是耐酸耐熱的，因為通常采用的是外酶法。由於所用酶的限制，普魯蘭酶可以在兩步反應的任壹步中加入，但必須滿足上述反應條件。因此，普魯蘭酶的酶學性質必須滿足酶水解制糖的現有條件，即耐酸性和耐熱性。
二、普魯蘭酶的研究現狀
1.產支鏈澱粉酶的微生物
普魯蘭酶最早由Bender和Wallenfels在1961年由Aerobacter產生。
產氣)是通過發酵獲得的。在他們報道了該酶的良好性能後，各國研究者經過廣泛深入的研究，從不同地區的微生物中獲得了該酶，掀起了開發普魯蘭酶的高潮。但到目前為止，雖然已經發現很多微生物都可以產生普魯蘭酶，但是由於目前工業生產條件(酸度和溫度)的限制，大多數微生物產生的普魯蘭酶都沒有商業價值。下面簡單介紹壹下普魯蘭酶產生菌。
1.1蠟狀芽孢桿菌真菌變種
是日本的ToshiyukiTakasaki在1975年發現的。該菌株同時產生兩種澱粉酶:？-澱粉酶和支鏈澱粉酶。最適反應條件為pH 6 ~ 6.5，溫度50℃，最大轉化率(澱粉水解生成麥芽糖)約為95%。酶學研究表明，該酶在pH5和60℃下仍保持大部分活性，該菌株營養細胞呈桿狀，聚集並生長成短而不等的無序鏈，不動，革蘭氏陽性，出芽時細胞無明顯擴張。該菌株最適生長溫度為30℃ ~ 37℃，最高生長溫度為41℃ ~ 45℃。可以使用葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、海藻糖、澱粉和糖原。
1.2嗜酸普魯蘭分解芽孢桿菌普魯蘭。
80年代初，丹麥Novo公司獲得了該菌株，該菌株產的普魯蘭酶耐熱。
(60℃)，耐酸性(pH4.5)。該公司在研發方面投入巨資，1983 11月。該公司在日本和歐洲市場以商品名Prornozyme進行商業銷售。如今，它是應用最廣泛、產量最大的普魯蘭酶。芽孢桿菌。解酸乳桿菌呈桿狀。經過幾個小時的深層發酵，可以觀察到原生質體樣細胞的膨大細胞，細胞比較穩定，充滿圓柱體或橢球體。革蘭氏反應呈陽性，在37℃生長良好，45℃以上不長，pI-1在6.5以上，在以普魯蘭為碳源的培養基(pH4.8 ~5.2)上生長良好。
1.3枯草芽孢桿菌
在1986中，日本Yushiyuki Takasaki報道了壹株能產生耐熱耐酸普魯蘭酶的菌株，命名為枯草芽孢桿菌TU。該菌株產生的酶為普魯蘭酶和澱粉酶的混合物，可水解澱粉為麥芽三糖和麥芽三糖，水解的普魯蘭酶為麥芽三糖，其中普魯蘭酶最適pH為7.0 ~ 7.5，但在pH5.0時也有50%左右的酶活，該普魯蘭酶最適溫度為60℃。
1.4耐熱氯磺隆
1987.德國的E.madi報道了壹種能同時產生α-澱粉酶、普魯蘭酶和糖化酶的菌株:耐熱梭菌和產硫菌。該菌株產生的普魯蘭酶具有較寬的溫度適應範圍(40℃ ~ 85℃)，在pH 4.5 ~ 6.0具有較高的活性。無疑將拓展這種普魯蘭酶的應用領域。
1.5 naganoensis桿菌，deramificans桿菌，芽孢桿菌。酸支鏈澱粉
在20世紀90年代，Deweer發現了壹種產普魯蘭酶的芽孢桿菌。富村篩選出了結核桿菌。這兩種菌株產生的普魯蘭酶的酶學性質與芽孢桿菌相似。這兩個菌株是中度嗜酸的，不會在pH6.5以上生長，也不會在45℃以上生長。這兩株普魯蘭酶產生菌的發現進壹步拓寬了普魯蘭酶的應用範圍。
1.6產普魯蘭酶的嗜熱細菌
20世紀80年代以來，人們逐漸意識到在正常的自然條件下很難篩選出極端耐熱的普魯蘭酶產生菌，於是各國科學家都把目光投向了溫泉嗜熱菌的篩選，現在已經取得了更多的成果。vorcaldarius等芽孢桿菌產生普魯蘭酶的最適溫度為75 ~ 85℃，最適pH為6.3。海洋嗜熱棲熱菌的最適溫度和最適pH值分別為90℃和6.0，嗜熱棲熱菌的最適溫度和最適pH值分別為75℃和5.5，保那沃氏殺藻的最適溫度和最適pH值分別為80 ~ 85℃和6.0。
2.普魯蘭酶的分子結構
到目前為止，已經克隆了許多普魯蘭酶的基因，但是還沒有關於普魯蘭酶結構的報道。然而，根據基於序列相似性的糖鍵水解酶的分類，支鏈澱粉酶屬於13家族。澱粉酶家族包含30多種酶，可分為水解酶和轉移酶。異構酶分為三類。這些酶可以水解和合成？~1.4,?~1.6,?~1.2,?~1.3,?~1.5,?~ 1.1糖苷鍵。許多這類酶的結構已被報道，它們都采用了(？/?)8、通過生物信息學研究，該家族所有的蛋白質都具有相同的結構，酶的活性中心是(？/?)8折疊管的結構被命名為疇A..13家族中的大多數酶也有結構域B，它位於(？/?)折疊管裏8個，第三個？層狀和第三種？螺旋之間的序列具有結構和長度差異大的特點，推測其功能與底物的結合有關。緊接著(？/?)8折管後還是c域，其次是c域，部分家族成員也有d域。
3.普魯蘭酶的應用
普魯蘭酶是食品工業中廣泛使用的酶制劑和加工助劑。它能特異性分解澱粉及其衍生的低聚糖分支中的支鏈澱粉和糖原分子。~ l，6糖苷鍵打破分支結構，形成不同長度的直鏈澱粉。因此，當這種酶與其他澱粉酶結合使用時，澱粉可以完全糖化。近年來，普魯蘭酶作為壹種新型澱粉酶，已應用於以澱粉為原料的食品等工業部門，在食品工業中具有以下功能:
3.1單獨使用支鏈澱粉酶將支鏈澱粉轉變為直鏈澱粉。
直鏈澱粉具有凝結和易形成結構穩定的凝膠的特性，可用作韌性食品包裝膜。這種膜適合作為食品的保護層，因為它對氧和油脂具有良好的隔離，並且具有良好的塗覆性能。也適用於澱粉軟糖的制造，也可作為果醬增稠劑，用於高含油量食品的灌裝，防止漏油，肉類食品加工。近年來，生物降解膜在食品工業中得到提倡，直鏈澱粉在這些方面有很大的發展前景。豆類的直鏈澱粉含量較高，因此綠豆澱粉制成的粉絲韌性優於其他澱粉。如果用普魯蘭酶處理谷物澱粉，然後制成直鏈澱粉，就可以制成高品質的粉絲。在壹般的谷物澱粉中，直鏈澱粉含量只占20%，支鏈澱粉含量在80%左右。工業上每生產1噸直鏈澱粉，就有4噸副產品支鏈澱粉。雖然美國通過遺傳育種獲得了含60%直鏈澱粉的玉米新品種，但不適合大規模生產。普魯蘭酶在國外已被用於改變澱粉結構，可將支鏈澱粉轉變為直鏈澱粉。據報道，用這種方法產率可達100%。直鏈澱粉的制作方法是:先用普魯蘭酶分解液化的樹枝使其轉化為直鏈澱粉，再用丁醇或緩冷沈澱澱粉。然後回收含有少量水的結晶沈澱，最後通過低溫噴霧幹燥制得粉狀直鏈澱粉。
3.2普魯蘭酶和？~ (13)澱粉酶生產麥芽漿
麥芽糖是我國傳統的澱粉糖產品，含有壹定量的麥芽糖，廣泛應用於糖果、糕點等食品行業。現在的制作方法是什麽？~澱粉酶液化再利用？~澱粉酶水解支鏈澱粉，只能水解側鏈。接近十字位置？當糖苷鍵為~ 1.6時，水解反應停止。但如果用普魯蘭酶進行同步水解，可以使支鏈斷裂，提高澱粉酶的水解度，降低澱粉酶的水解度。極限糊精的含量大大提高了麥芽糖的得率，有利於麥芽糖漿的生產。目前，普魯蘭酶糖化已經進行了大規模實驗。
測試條件如下。每批投料量約900kg碎米，漿液濃度15 ~ 16be？計皮劑量為1.5%(碎米用)。~ (13)澱粉酶活性大於2000單位/克，pH5.8普魯蘭酶活性為45000 ~ 55000單位/克，由產氣單胞菌產生，每批用量為1公斤。結果表明，與對照糖相比，還原糖增加65438±04.8，麥芽糖含量增加45.6，糊精含量減少26.7。與高濃度葡萄漿相比，高濃度麥芽糖漿具有不易結晶、吸濕性低的特點，因此被廣泛應用於食品工業。普魯蘭酶和β-澱粉酶的組合成本低，麥芽糖得率達到70%左右，甚至更高。
3.3用於酶法啤酒糖化。
啤酒生產中的麥芽不僅是釀造啤酒的主要原料，也為釀造過程提供了豐富的酶源。啤酒釀造的糖化過程中，分解麥芽中澱粉的主要酶有哪些？~澱粉酶，？~澱粉酶和分解澱粉？~ 1.6 R-酶(植物普魯蘭酶或植物普魯蘭酶)。？~ (2+)澱粉酶通過與另外兩種澱粉酶的協同作用，將澱粉分解為麥芽糖(包括少量麥芽三糖和極少量葡萄糖)和低分子糊精。從而使麥芽汁具有理想的糖成分。工業生產中為了節省麥芽用量，采用所謂的額外酶解糖化，即在減少麥芽用量的前提下，增加澱粉輔助原料的配比，並添加適當種類的酶制劑進行搪瓷。為了將大麥等輔料完全糖化，需要加入α-澱粉酶進行分解？~ 1.6糖苷鍵普魯蘭酶制劑等。當單獨使用α-澱粉酶時，產生麥芽糖和麥芽三層是不完全的。澱粉被分解了怎麽辦？如果~ 1.6糖苷鍵的酶活不足，澱粉分解不徹底，導致可發酵糖含量低，啤酒的發酵度達不到要求。如果可以分解？~ 1.4和？糖苷鍵為~ 1.6的糖化澱粉酶的反應產物是葡萄糖，容易使酒的味道變淡。使用普魯蘭酶和？~ (13)澱粉酶效果較好，其分解產物主要是麥芽糖和少量的麥芽多糖。用外加酶法糖化時，酶制劑的用量為:澱粉酶6-7單位/克大麥和大米:蛋白酶60-80單位/克，並添加菠蘿蛋白酶10ppm和普魯蘭酶50單位/克大麥。上述三種酶制劑在糖化或醇化開始時添加。
總之，普魯蘭酶作為酶制劑和加工助劑在食品工業中具有廣闊的發展前景。
研究目的和意義:
酶制劑工業是20世紀70年代以來形成的壹個重要產業。目前世界酶制劑總產值為6543.8+000億美元，我國產值約為6543.8+000億元人民幣。隨著其應用領域的不斷擴大和新酶種的開發，這壹市場發展迅速。然而，全球酶制劑行業幾乎被幾家外國公司壟斷，其中丹麥的諾華幾乎占全球總銷售額的壹半。該研究對普魯蘭酶的開發和酶制劑工業的發展具有重要意義。
其次，我國從20世紀70年代開始研究開發普魯蘭酶，但開發的普魯蘭酶既不耐熱也不耐酸，限制了其工業應用。為了改變我國對進口產品的依賴，填補這壹領域的空白，找到壹條本土化的道路，本研究的目的是利用天然微生物資源——普魯蘭酶，提高我國澱粉原料的利用率，從而提高整個澱粉加工業的生產率，這對我國澱粉加工業的意義不言而喻。
研究內容(內容、結構框架、重點難點):
1.普魯蘭酶產生菌的篩選
(1)樣本采集；
(2)菌株的初步篩選；
(3)菌株復篩；
(4)菌種的保存方法；
(5)酶活性測定方法的建立。
2.普魯蘭酶產生條件的研究。
(1)碳源和氮源對發酵產酶的影響:
(2)初始PH對產酶的影響；
(3)接種量對產酶的影響；
(4)發酵溫度對產酶的影響；
(5)金屬離子對產酶的影響。
關鍵點或關鍵技術:
(1)純菌株的分離；
(2)菌株鑒定方法的選擇。
研究方法和手段:
1.普魯蘭酶產生菌的篩選
(1)樣本采集:選擇合適的地點(面粉廠、菜地、果園等。)采集土壤樣本。
(2)菌種初篩:將采集的土樣用無菌水稀釋後，塗於含澱粉培養基中的平板上，37℃培養48h後，與碘溶液顯色反應，將含澱粉酶的菌落接種於斜面上保存。
(3)菌株的復篩:將前期分離的產澱粉酶菌株塗於普魯蘭平板上，37℃培養48h，然後用95%乙醇進行透明圈實驗。透明圈的產生表明該菌株產生普魯蘭酶，將產生透明圈的菌落挑在斜面培養基上培養。
(4)菌種保藏法:4℃低溫保藏。
(5)酶活測定方法的建立:將發酵液離心，在520nm處用DNS顯色法測定吸光度，並測定葡萄糖的標準曲線，由標準曲線計算普魯蘭酶的活性。
2.普魯蘭酶產生條件的研究。
(1)碳源和氮源對發酵產酶的影響:用不同的碳源和氮源培養壹段時間，測定酶活力。其他條件相同:接種量、裝瓶量、初始PH值、轉速、培養時間。)
(2)初始pH對產酶的影響:使用相同的發酵培養基，在不同的初始PH下接種相同量的種子液..在相同條件下培養，測定發酵液的酶活。其他條件相同:接種量、裝瓶量、轉速、最佳培養溫度、最佳培養時間。)
(3)接種量對產酶的影響:分別以2%，4%，6%，8%的接種量接種到發酵培養基中，
將10%、14%和18%的種子培養液在相同條件下培養於最佳碳源、氮源和最佳初始PH的培養基中，分別檢測酶活性。(采用上面確定的最佳碳源、氮源和最佳初始PH。)
(4)發酵溫度對產酶的影響:使用同壹種培養基，在不同溫度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)下培養壹定時間，測定酶活力。
(5)金屬離子對產酶的影響:在基礎培養基中添加少量不同的金屬離子，發酵後測定酶活力。(金屬離子包括:錳離子、鈣離子、鋅離子、鎂離子、鐵離子、銅離子。)
研究進展
:完成項目總體進度的30%，樣品土壤樣品的采集和前期準備，菌種的初步篩選，包括(樣品土壤原液的塗布培養和搖床培養，產普魯蘭酶菌種的選擇和斜面培養)。
項目總體進度的50%，菌種復篩，包括(普魯蘭酶產生菌的篩選和斜面培養)，葡萄糖標準曲線的測定，酶活測定方法的建立，根據酶活進行菌種復篩。
:完成項目總體進度的80%，研究產酶條件。包括碳源、氮源、初始PH值、接種量、發酵溫度和金屬離子。通過單因素實驗確定了發酵培養基的最佳碳源、氮源、初始PH值、接種量、發酵溫度和金屬離子。
2009、4?09年5月:項目整體進度100%，項目總結，論文撰寫。
文獻綜述(包括:國內外研究理論、研究方法、進展、存在問題、參考依據等。)
普魯蘭酶是在1961年Bender H .等人研究壹種產氣桿菌(克雷伯氏肺炎桿菌是典型的細菌)時首次發現的。經過對產生這種酶的微生物的大量研究，發現許多微生物都能產生這種酶，並篩選出壹些適合工業化生產的優良菌株。隨著該酶的應用和發展，耐熱普魯蘭酶的研究逐漸增多，該酶的基因已被成功克隆和表達。壹株產氣桿菌10016的普魯蘭酶在中國從65438到0976進行了研究。報道了該酶的生產條件、分離提取及其酶學性質，並對該酶的食品級提取工藝進行了研究。另外，陳、等從雲南熱泉水樣中篩選出壹株產普魯蘭酶的嗜熱菌株。通過誘導等實驗，酶活從0.069u/mL提高到1.70 U/mL，酶產量提高了約2500倍。該酶最適溫度為75℃，最適pH為4.5，具有壹定的耐熱性和耐酸性。
陳金泉等人從溫泉水樣中篩選出壹株產耐熱耐酸普魯蘭酶的野生菌株。根據形態特征、生理生化特征、細胞化學組成分析、16SrDNA序列比較、基因組DNA G+C摩爾百分比、同源性比較等實驗，鑒定為脂環酸芽孢桿菌新種，產酶最適溫度為60℃。楊雲娟等利用畢赤酵母成功構建了高表達普魯蘭酶的基因工程菌株。在最佳發酵條件下，搖瓶發酵普魯蘭酶活可達350.8U/mL，產量可達504.5-510.1U/mL。該酶的最適溫度為60 ℃,最適pH為4.5，具有良好的耐熱性和耐酸性。目前國內還沒有能夠獨立生產普魯蘭酶的廠家，要實現低成本、本地化生產還有很長的路要走。
技術在耐熱脫支酶研究中的應用，使耐熱異澱粉酶的研究取得了很大進展。Coleman等人將嗜熱厭氧菌T. brockii的普魯蘭酶基因克隆到枯草芽孢桿菌中，克隆分泌的普魯蘭酶量高於原始菌株。Okada等人將編碼嗜熱脂肪芽孢桿菌耐熱異澱粉酶的基因克隆到枯草芽孢桿菌中，得到的轉化菌株的異澱粉酶在60℃下穩定15分鐘。Burchadf會的。克隆並在大腸桿菌中表達了38%的嗜熱異澱粉酶基因，獲得的酶的最適pH和溫度與出發菌株相同，在高溫下仍能保持活性。Antranikiam等人將來自Pyrococcus riousous的異澱粉酶基因克隆到大腸桿菌中，並分離出該酶蛋白。盡管如此，還沒有轉基因耐熱異澱粉酶工程菌應用於工業生產的報道。眾所周知，用物理和化學誘變劑單獨或聯合處理微生物細胞是選育高產突變菌株的有效經典方法。它在培育各種抗生素、氨基酸和核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和澱粉酶)的高產突變菌株中發揮了極其重要的作用，至今仍是方便有效的方法之壹。
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