真核mRNA有壹個特征結構，即在大多數哺乳動物細胞的3’端有壹個5’端的帽子結構(m7G)和壹個由20-300個腺苷酸組成的3’端的poly(A)尾，通常用poly(A+)表示。這種結構為真核mRNA分子的提取和純化提供了極其方便的選擇性。
根據mRNA 3’端poly(A)尾的結構特點，設計了mRNA分離純化的壹般原則。當總RNA流過oligo (dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異性吸附在oligo(dT)纖維素柱上。在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可以被洗去並通過寡聚(dT)纖維素柱兩次以獲得相對純的mRNA。
目前，常用的mRNA純化方法有:
(1)寡(DT)-纖維素柱層析，這是分離mRNA的標準方法；
(2)寡聚(DT)-纖維素的液相離心，即直接將寡聚(DT)-纖維素加入總RNA溶液中並使mRNA與寡聚(DT)-纖維素結合，通過離心收集寡聚(DT)-纖維素/mRNA復合物，然後通過洗脫液分離mRNA，然後通過離心除去寡聚(DT)-纖維素；
(3)其他方法:如寡聚化(DT)-磁珠法。
本實驗采用(1)方法分離純化mRNA。
試劑和設備
(1)試劑
1.0.1 mol/L NaOH，每組200mL。
2.低聚(dT)-纖維素
3.加載/洗滌緩沖液1: 0.5 mol/L NaCl，20 m mol/L Tris-HCl (pH 7.6)，每組250mL。
或0.5摩爾/升NaCl，20毫摩爾/升tris-HCl (ph 7.6)，1毫摩爾/升EDTA (ph 8.0)，0.1% SDS。
4.洗滌緩沖液2: 0.1mol/L NaCl，20mol/L Tris-HCl (pH 7.6)，250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.05。
配制時，可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)母液，高壓滅菌後根據各組分的確切含量進行高壓滅菌，冷卻至65℃後，加入65℃(30分鐘)孵育的10%SDS至終濃度。
5.5 mol/l NaCl，每組65438±00ml。
6.3 mol/L NAAC pH 5.2，每組65438±00ml。
7.不含核糖核酸酶的雙蒸水(DEPC水)，每組65438±000ml。
8.70%乙醇，每組65438±00ml。
註意:溶液5和6應使用0.1% DEPC處理過夜，而溶液1、3、4和8應使用經0.1% DEPC處理的無核糖核酸酶雙蒸水制備，Tris應不含核糖核酸酶。溶液配制好後，最好按照壹次實驗所需的量分裝成多瓶(如10ml或50ml/瓶)，每次實驗只使用壹瓶，避免重復操作造成溶液的汙染。
(2)設備
1.恒溫水浴箱
2.冷凍高速離心機
3.紫外分光光度計
4.巴斯德吸管
5.玻璃棉
6.5ml壹次性註射器
操作方法
(1)寡(dT)纖維素的預處理
1.用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g低聚(dT)纖維素。
2.將懸浮液放入填充有經DEPC處理的玻璃棉的巴斯德移液管中並高壓滅菌。柱床體積為0.5-1.0mL，用三倍柱床體積的無核糖核酸酶無菌雙蒸水洗滌寡(dT)纖維素。
3.用3-5倍的柱床洗滌緩沖液I洗滌低聚(dT)纖維素，直到流出液的pH值小於8.0。
4.將處理後的低聚(dT)纖維素從巴斯德吸管中倒出，用適當的柱床洗滌緩沖液I懸浮，4℃保存備用。
(2)總RNA濃度的調節
1.將實驗1中提到的總RNA轉移到合適的離心管中。如果總RNA的濃度大於0.55mg/mL，用不含RNA酶的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL。總RNA的濃度對於去除rRNA非常重要。RNA溶液在65℃的水浴中加熱5分鐘，然後迅速插入冰中冷卻。
2.加入1/10體積的5摩爾/升NaCl，將RNA溶液中的鹽濃度調節至0.5摩爾/升..
(mRNA的分離
1的組合。含低聚(dT)-纖維素的mRNA:用移液管重懸低聚(dT)-纖維素，根據下表取適量低聚(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，通過倒置幾次將低聚(dT)-纖維素與RNA混合。水浴恒溫37℃，輕輕搖動15分鐘。
總RNA (mg)寡(dT)-纖維素(mL)洗滌緩沖液1.2(mL)洗脫體積(mL)
& lt0.20.21.01.0
0.2-0.50.51.51.5
0.5-1.01.03.03.0
1.0-2.02.05.05.0
2.轉移:取1 5ml壹次性註射器，用適量高溫滅菌的玻璃棉塞住前端，固定在無核糖核酸酶支架上，然後將寡(dT)-纖維素/RNA懸液轉移到註射器中，將塞子推到底部，將含有未結合RNA的液體排入無核糖核酸酶離心管中(直到確定獲得足夠的mRNA)。
3.洗滌:根據上表，用註射器緩慢吸取適量洗滌緩沖液1，輕輕搖勻，充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推塞，用不含RNase的離心管收集洗脫液。確定每個試管的OD260，當洗脫液中的OD為0時，準備洗脫。
4.洗脫:根據上表，直接用註射器緩慢吸取適量的洗脫緩沖液2或不含RNase的雙蒸水至註射器中，使mRNA-oligo(dT)-纖維素充分重懸，推塞收集洗脫液，柱床體積為1/3至1/2。
5.測定每管的OD260，在4℃下合並含RNA的洗脫液組分，2500g，離心2-3分鐘，將上清液轉移到新的離心管中，除去殘留的寡(dT)-纖維素。
6.沈澱:向洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc (pH5.2)，然後加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，在-20℃靜置30分鐘或過夜。
7.離心收集:12000 g，4℃離心15分鐘，小心棄去上清液，此時往往看不到mRNA沈澱。用70%乙醇沖洗沈澱物，在4℃離心5分鐘，小心棄去上清液，將沈澱物風幹10分鐘。將mRNA沈澱溶解在適量的無核糖核酸酶雙蒸水中，並立即用於cDNA合成(或儲存在70%乙醇中，並在-70℃下)。
8.定量:測定OD260和OD280，計算產率和OD260/OD280的比值(與前面的實驗相同)。
註意事項和提示
1.整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境的規則。
2.提取的總RNA必須是完整的，不能被降解，這是保證mRNA質量的前提。
3.總RNA與低聚(dT)-纖維素的比例應該合適。總RNA過多容易導致mRNA不純。
4.RNA溶液在與低聚(dT)-纖維素結合之前必須在65℃加熱5分鐘。這壹步非常重要，它的作用(1)破壞了mRNA的二級結構，尤其是poly(A+)尾部的二級結構，使poly(A+)尾部充分暴露，提高了poly(A+)RNA的回收率。(2)解離的mRNA與rRNA的結合。加熱後應立即插入冰中，以避免mRNA因溫度緩慢下降而恢復二級結構。
5.需要註意的是，mRNA不能被DNA汙染，即使被1 ppm的DNA汙染，也能嚴重影響實驗結果。
6.在mRNA制備後，可以通過變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和DNA汙染。提取的mRNA應該分散在0.5~8.0kb的範圍內，沒有明顯的條帶，但大部分mRNA應該在1-2.0kb的範圍內(如下圖)。壹般來說，第壹次純化分離後的mRNA中仍會有少量的rRNA殘留，但壹般不會對後續實驗產生很大影響。如果有足夠的樣本，可以對第壹次純化分離後的mRNA進行再次純化，進壹步提高其純度。
泳道1，0.24–7.5 kb RNA分子量標記；
泳道2，小鼠肝臟總RNA
泳道3，小鼠肝臟mRNA
7.為防止mRNA降解，應避免多次凍融，可將mRNA少量包裝保存。另外，如果有低溫冰箱，最好保存在-70℃ ~-80℃。mRNA也可以在-70℃的70%乙醇中保存壹年以上。
8.oligo (dT)纖維素柱使用後可用0.3mol/l NaOH洗滌，然後在色譜柱中加入樣品緩沖液進行平衡，並與0.02%疊氮化鈉(NaN3)壹起保存在冰箱中以備再次使用。每次使用前，應依次用NaOH、滅菌ddH2O和色譜柱上樣緩沖液清洗柱床。
9.壹般來說，107哺乳動物細胞可以提取1-5 μ g的Poly (A+) RNA，相當於上柱總RNA的1%-2%。
實驗安排
1.第壹天:壹次性塑料制品和玻璃器皿的試劑制備和RNase處理(0.1%DEPC浸泡或高溫幹烤)。
2.第二天:(1)、(2)、(3) 1-6。
3.第三天:進行(3) 7和變性瓊脂糖凝膠電泳提取mRNA。
4.為了避免保存時間過長導致RNA降解，最好將總RNA提取、mRNA分離純化、RT-PCR、cDNA文庫構建等實驗安排在連續的時間內進行。
實驗報告的要求和思考問題
OD260和OD280的值為1。mRNA、OD260/OD280比率和計算的mRNA產量；
2.mRNA變性的瓊脂糖凝膠電泳結果；
3.為什麽說mRNA提取是cDNA合成成功的關鍵？
附錄:
1.逆轉錄酶及其活性
逆轉錄酶(Reversetranscriptase)又稱RNA指導的DNA聚合酶，是壹種以RNA為模板合成DNA的酶。這種酶是美國科學家H.M.Temin和D.Baltimore分別於1970年在動物致癌RNA病毒中發現的，他們於1975年獲得了諾貝爾生理學或醫學獎。現已發現，當RNA致癌病毒如Rous sar-coma病毒進入宿主細胞後，其逆轉錄酶首先催化合成與病毒RNA互補的單鏈DNA，然後復制雙鏈DNA，通過另壹種病毒酶的作用整合到宿主的染色體DNA中。整合的DNA可能休眠幾代，當條件合適時被激活。只有利用宿主的酶系統才能轉錄成相應的RNA，壹部分作為病毒的遺傳物質，另壹部分作為mRNA翻譯成病毒特異性蛋白。最後，這些RNA和蛋白質被組裝成新的病毒粒子。在這個過程中，遺傳信息流動的方向是從RNA到DNA，正好與轉錄過程相反，所以稱為反向轉錄(reversetranscription，RT)。逆轉錄酶在很多方面和DNA聚合酶相似。它含有Zn2+，以脫氧核苷三磷酸為底物，從5’到3’合成DNA。反應需要引物。目前已經發現了許多動物逆轉錄病毒，近年來也發現了幾種人類逆轉錄病毒。艾滋病毒也是壹種逆轉錄病毒。
壹些生物公司已經純化了逆轉錄酶，並生產了自己的旗艦產品，如TAKARA純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV)逆轉錄酶和Invitrogen從表達克隆的莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶基因的大腸桿菌中分離的鼠白血病病毒(MLV)逆轉錄酶。以及進壹步開發的ThermoScript、Gibco開發的superscriptⅱ等。，可用作合成某些RNA的互補DNA的工具酶，也可用於DNA序列分析和克隆重組DNA。
AMV逆轉錄酶由兩個具有幾種酶活性的多肽亞單位組成，包括RNA依賴的DNA合成、DNA依賴的DNA合成和DNA:RNA雜交體的RNA部分的核酸內切酶降解(RNase H活性)。MLV逆轉錄酶只有單壹的多肽亞基，同時具有依賴RNA和依賴DNA的DNA合成活性，但在RNA:DNA雜交體中降解RNA的能力較弱，對熱的穩定性比AMV逆轉錄酶差。MLV逆轉錄酶可以合成更長的cDNA(如大於2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶在利用RNA模板合成cDNA時，最適pH、鹽濃度和溫室不同，因此在合成第壹條鏈時相應調整條件是非常重要的。因為RT-PCR的靈敏度會受到cDNA合成量的影響，所以良好的逆轉錄效果非常重要。研究表明，熱腳本比AMV敏感得多。RT-PCR產物的大小受限於逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是在克隆較大的cDNA時。與MMLV相比，superscriptⅱ顯著提高了長RT-PCR產物的產量。
除了自身的聚合酶活性外，M-MLV和AMV都具有內源性RNA酶活性。RNA酶活性與聚合酶活性競爭，在RNA模板和DNA引物或cDNA延伸鏈之間形成雜交鏈，降解RNA: DNA復合物中的RNA鏈。被RNA酶活性降解的RNA模板不能再作為cDNA合成的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此，消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將大有裨益。研究表明，核糖核酸酶的上標ⅱ逆轉錄酶、MMLV逆轉錄酶和ThermoScript逆轉錄酶，以及核糖核酸酶的AMV獲得的全長cDNA比MMLV和AMV多。RNaseH-的逆轉錄酶同時增加了熱穩定性，因此反應可以在高於正常37-42℃的溫度下進行。
2.引物的設計壹般遵循以下原則:
1)典型引物的長度為20-24個核苷酸。引物需要足夠長，以保證序列的唯壹性，減少序列存在於非靶序列位點的可能性。但是太長的引物可能與錯配的序列雜交，降低了特異性，同時比短序列雜交慢，從而降低了產量。
2)設計5”末端和中間區域為G或C、GC含量為50% ~ 60%的引物，以提高引物的穩定性和與靶序列的雜交性。
3)盡量不要在3”端富含GC。設計引物時，確保最後5個核苷中有3個A或T。然而，因為3”末端核苷需要與聚合酶催化延伸的模板退火，為了避免3”末端的錯配，應該盡可能避免末端作為核苷a。
4)盡量避免引物對3”端的互補序列，避免形成引物二聚體，抑制擴增。如果引物序列可能產生內部二級結構，破壞引物的退火穩定性，也應盡量避免。
此外，靶序列中不存在的額外序列，如限制性位點和啟動子序列，可以添加到引物的5”末端，而不影響特異性。
有時，只有有限的序列信息可用於引物設計。例如，如果只知道氨基酸序列，可以設計簡並引物，並且可以使用更高的引物濃度(1μM至3μM)，因為簡並混合物中的許多引物對靶模板不是特異性的。
為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好降低簡並性。次黃嘌呤可以與所有堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3”末端使用簡並堿基，因為3”末端最後三個堿基的退火足以在錯誤的位點啟動PCR。