2)加入待測樣品，保溫反應。樣品中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原-抗體復合物。
清洗以去除其他未結合的物質。
3)加入酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標記的抗體結合，未結合的抗原被徹底洗滌。
此時，固體載體上攜帶的酶的量與樣品中抗原的量相關。
4)加入底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。樣品中抗原的量可以通過顏色比較來測量。
在臨床試驗中，該方法適用於檢測各種大分子抗原如蛋白質，如HBsAg、HBeAg、
AFP，hCG等。只要獲得針對被檢測抗原的抗體，就可以用來包被固相載體，制備酶結合。
如果抗體的來源是抗血清，最好從不同種類的動物身上取抗體進行包被和酶標。
如果使用單克隆抗體，壹般選擇針對抗原上不同決定簇的兩種單克隆抗體分別包被固相。
這種雙位點夾心法具有高度的特異性，可用於標記待測樣品和酶
抗體壹起孵育用於進壹步檢測。
在壹步測定中，當樣品中被檢測抗原的含量較高時，將多余的抗原分別用固相抗體和酶標記。
抗體結合，不再形成夾心復合物。這類似於沈澱反應中抗原過量的現象，當反應
顯色後的吸收值(位於抗原過量區)和標準曲線(位於抗體過量區)有壹定的抗原濃度。
吸光度值相同(見1.3.2，圖1-4)，如果用正常方法測定，結果會低於實際含量。
形象的說就是鉤狀效應，因為標準曲線在達到峰值後向下彎曲成鉤狀。掛鉤效應嚴重。
但是，反應甚至可能不顯色，導致假陰性結果。因此，壹步試劑測定的樣品中的含量可能會出現異常。
當增加物質(如血清中HBsAg、AFP、尿中hCG等)時。)，要註意可測範圍的最高值。
用高親和力單克隆抗體制備此類試劑可減弱鉤效應。
如果被測分子的不同位點有多個相同的決定簇，如HBsAg的A決定簇，也可能是
固相和酶結合物包被有針對該決定的相同單克隆抗體，但在檢測HBsAg時應註意亞型
問題:HBsAg有四種亞型:adr、adw、ayr和ayw4，盡管每種亞型都有相同的決定反應。
性別，這也是用單克隆抗體做夾心法時要註意的問題。
雙抗體夾心法檢測抗原的另壹個註意點是類風濕因子(RF)的幹擾。RF是壹種自身抗體，主要是IgM型，可與許多動物IgG的Fc片段結合。如果雙抗體夾心法檢測用的血清樣本中含有RF，可作為抗原成分，同時可與固相抗體和酶標抗體結合，出現假陽性反應。f(ab’)或Fab片段被用作酶綴合物的試劑，因為它被除去了。
雙抗體夾心ELISA試劑是否受RF影響已被列為評價指標。
雙抗體夾心法適用於二價或更高的大分子抗原的測定，但由於不能形成兩點夾心，不適用於半抗原和小分子單價抗原的測定。