方法1:
1.取兩片幼嫩鮮葉,置於預冷的研缽中,倒入適量液氮,迅速研磨成粉末,然後加入3ml預熱的2%CTAB提取緩沖液和50ul抗氧化劑2-巰基乙醇,繼續研磨成稍具流動性的糊狀或粥狀,轉移至1.5ml離心管中,65℃水浴保溫60min左右。
2.待混合物冷卻至室溫後,加入600 ul CI(氯仿:異戊醇= 24: 1)溶液並混勻,輕輕倒置離心管幾次,使管內混合物變成乳液,室溫下以10000rpm離心10min,將上清液轉移至另壹個幹凈的離心管中。
3.重復步驟(2)壹次。
4.向步驟(3)的上清液中加入2.5倍體積的無水乙醇,仔細混合,在-20℃冷藏30分鐘以上,在4℃沈澱DNA,以65438±02000 rpm離心65438±00分鐘。
5.棄去上層有機溶劑,加入500ul75%乙醇洗滌沈澱,4℃下8000rpm離心5min,棄去上清液,洗滌沈澱3次。
6.倒置或37度培養箱幹燥。
7.加入50微升緩沖液溶解DNA,冷藏於-20℃備用。
方法二:
1.向50毫升離心管中加入20毫升提取緩沖液I,並在60℃水浴中預熱。
2.植物5-10g,切塊,在研缽中加入液氮研磨成粉,然後立即倒入預熱好的離心管中,用力搖勻,60℃水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA得率高),偶爾搖勻。
3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,倒置混勻(需戴手套防止皮膚損傷),室溫靜置5-10分鐘,使水相和有機相分離(必要時再混勻)。
4.在室溫下以5000rpm的速度離心5分鐘。
5.小心地將上清液轉移到另壹個50ml離心管中,加入1倍體積的異丙醇,混勻,室溫放置壹段時間,產生絮狀DNA沈澱。
6.將1ml TE加入1.5 mlependorf中,用帶鉤的玻璃棒取出DNA絮狀物,吸幹在幹凈的吸水紙上,轉移到含有TE的離心管中,DNA會迅速溶解在TE中。
7.如果DNA沒有形成絮狀沈澱,可以5000rpm離心5分鐘,然後將沈澱轉移到te管中。用這種方法收集到的沈澱物往往很難溶解在te中,可以放在60℃的水浴中15分鐘以上,以幫助溶解。
8.以3000rpm離心DNA溶液5分鐘,並將上清液倒入幹凈的5ml離心管中。
9.加入5μlrna Sea(10μg/μL)37℃10分鐘,去除RNA(RNA壹般對DNA操作和分析沒有影響,可省略此步驟)。
10.加入1/10體積的3mol/L NaAc和2×體積的冰鎮乙醇,混勻,在-20℃靜置20分鐘左右,DNA會形成絮狀沈澱。
11.用玻璃棒取出DNA沈澱,用70%乙醇沖洗,然後吸幹在幹凈的吸水紙上。
12.將DNA溶解在1毫升Te中,並儲存在-20。
13.取2μlDNA樣品,在0.7%瓊脂糖凝膠上電泳,檢測DNA的分子大小。同時將15μl稀釋20倍,測定OD260/OD280檢測DNA含量和質量。
方法三:
植物DNA的SDS提取;
測試試劑:
1.研磨緩沖液:將59.63gNaCl、13.25g檸檬酸三鈉、37.2 g EDTA-Na分別溶解並合二為壹,用0.2mol/L NaOH調至pH7.0,定容為1000ml。
2.10×SSC溶液:稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉,分別溶解,定容至1000ml。
3.1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀釋10倍。
4.0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀釋10倍。
5.核糖核酸酶溶液:用0.1.4 mol/l NaCl溶液配成25mg/ml酶液,用1mol/LHCl,pH為5.0,使用前80℃水浴5min處理5min(破壞可能的脫氧核糖核酸酶)。
6.氯仿-異戊醇:將24毫升氯仿與1毫升異戊醇混合。
7.5mol/L高氯酸鈉溶液:稱取naclo 4·H2O 70.23g,先加入少許蒸餾水使其溶解,然後配制成100ml。
8.SDS(十二烷基硫酸鈉)化學試劑重結晶:將SDS放入無水乙醇中至飽和,然後溶於70 ~ 80℃的水浴中,趁熱過濾,冷卻,然後將濾液放入冰箱中,室溫下晾幹備用。
9、1摩爾/升.
10、0.2摩爾/升氫氧化鈉.
11、二苯胺乙醛試劑:1.5g二苯胺溶於100ml冰醋酸中,加入1.5ml濃硫酸,置於棕色瓶中,避光保存,加入0.1ml乙醛溶液[濃縮乙醛:H2O = 65438+]
12,1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。
13、0.05摩爾/升氫氧化鈉.
14、DNA標準溶液:取DNA25mg標準DNA溶於少量0.05mol.L-1NaOH中,然後用0.05mol/ln NaOH使體積達到25ml,再用轉移管將此溶液吸至5ml-50ml容量瓶中,加入5.0ml 1.5mol/LHC lo 4,混勻冷卻,再用0.5mol。