PCR技術不斷變化但從未淡出我們的視野，現在已經滲透到分子生物學領域的各個研究層面。特別是在今年全球爆發的疫情病中，它顯示了PCR技術的威力。那麽在科研中應該如何選擇傳統PCR、熒光定量PCR和數字PCR呢？
首先我們要明確，第三代PCR技術的所有基礎都來自於PCR反應的基本原理和PCR反應的三個重要階段，即指數階段、線性階段和平臺階段。
指數周期
在指數期，每個循環的PCR產物量增加了約1倍(假設反應效率為100%)，該階段的擴增反應具有很高的特異性和準確性。
線性周期(高可變性)
隨著PCR反應體系組分的消耗，其中壹種或多種組分限制了反應，導致反應變慢，每個循環中的PCR產物不再加倍。
平臺期
反應停止，不再產生更多的產物。因為每個樣品的反應動力學不同，所以每個反應會在不同的時間點進入平臺期，在平臺期就可以看到這些差異。
傳統PCR
傳統PCR通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR的最終產物(圖2)，但其局限性在於只能做定性分析。在圖3中，三個反應孔含有相同量的DNA模板，但到達平臺期後產生的熒光信號不同，說明擴增產物的量不同(由於反應動力學的變化)。這也說明傳統PCR平臺周期測量結果不壹，產生的DNA量可能不能反映初始情況，因此無法量化。
實時定量pcr
同樣在圖3中，發現三個反應孔的擴增曲線在指數期內完全壹致，表明在指數期內檢測將更準確，並且可以實現更準確的定量。閾值線是擴增產物的熒光強度超過背景時的熒光強度值，樣品達到該熒光強度值後的循環數稱為Cq值。通過比較未知濃度樣品和壹系列標準品的Cq值，可以準確確定未知反應中模板DNA的數量。
數字pcr
數字PCR是將樣本DNA隨機分配到獨立的反應單元中，每個反應單元包含或不包含1或更多拷貝的靶分子。在所有獨立的反應單元被平行擴增後，檢測每個反應單元的陰性或陽性熒光信號並進行統計分析，從而可以計算出原始樣品的拷貝數，而無需參照標準或內源對照或標準曲線。
傳統PCR、熒光定量PCR和數字PCR的選擇
深藍雲生物科技為您提供美國天藍CIELO的3 /6通道熒光定量PCR系統和法國Stilla Naica的全自動3色/6色液滴芯片數字PCR系統。
天藍色？Cielo？實時熒光定量PCR系統
來自美國Azure Biosystems，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據實驗要求靈活配置。該產品采用高能LED作為光源系統，可保證光源強度高，光源壹致性好；作為溫控系統，高品質的帕爾貼溫度模塊具有快速的升溫和降溫速率，可設置12柱的溫度梯度，跨度為30℃；優秀的CMOS攝影+光纖信號傳輸作為探測系統，CMOS探測靈敏度高，光纖傳輸速度快，沒有光損和幹擾。天藍色Cielo？實時熒光定量PCR系統可為您的科學研究提供高準確度、靈敏度和可靠性的實驗結果。
奈卡？微滴芯片數字PCR系統
法國Stilla Technologies Naica的數字PCR平臺是實現高靈敏度DNA/RNA絕對定量的技術工具。壹步移液操作可自動生成單層平鋪液滴，多基因單分子模板可擴增同壹反應液。通過三色或六色熒光通道檢測，自動QC可以識別多色熒光中的有效陰性和陽性液滴，從而實現DNA/RNA的高精度絕對定量。同時提供原始數據、單液滴追溯等功能，保證數據的真實性和可靠性。
參考資料:
1.賽克斯PJ，尼歐什，布裏斯科MJ，休斯E，康登J，莫利AA。用有限稀釋法定量PCR的目標。生物技術。1992;13(3):444-449.
2.王曉華，王曉華.數字PCR技術的應用[J].北京:科學出版社，2002 .美國國家科學院院刊，1999，96(16):9236-9241。
3.Heyries KA，Tropini C，Vaninsberghe M，等。百萬像素數字PCR。Nat方法。2011;8(8):649-651.
4.丁格爾TC，塞德拉克RH，庫克L，傑羅姆KR。液滴數字PCR與實時定量PCR對抑制物質的耐受性。臨床化學。2013;59(11):1670-1672.
5.微流控數字PCR和常規定量PCR用於檢測拷貝數變異的比較。核酸研究2012；40(11):e82。